技术服务

WB蛋白免疫印迹

服务简介
       WB(Western blot),即蛋白印迹或免疫印迹(immunoblotting),是一项在分子生物学、生物化学、免疫学等领域中应用非常广泛的技术。这一技术利用抗体与组织或细胞样品中特定蛋白的特异性结合作用,根据显色条带的位置和强弱实现蛋白鉴定和表达分析。

WB技术具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性。选用合适的内参抗体能够校正蛋白定量和上样过程中的误差,通过灰度计量可以定性或定量分析不同样品中蛋白表达情况。Western blot常用于鉴定某种蛋白,并能对蛋白进行定性和半定量分析。

用户提供:

需检测的样品,一抗(也可以选择由我公司提供),内参抗体由我公司提供。

送样要求:

离体后迅速超低温处理并-80 ℃冻存的组织样品,干冰运输;

组织:动物组织应不少于100 mg(绿豆大小以上),植物组织不少于500 mg;

细胞:大于5x106个细胞;

细胞或组织裂解液总蛋白浓度须大于1 mg/mL,单个样品不少于50 μL。 

实验步骤:

1、蛋白质抽提 
  A、实验对象为组织样品,取适量(250-500mg)新鲜组织样品,加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂(或核蛋白抽提试剂),匀浆后抽提总蛋白。 
  B、实验对象为细胞样品,每份样品取1×106~1×107细胞,PBS清洗细胞,去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂(或核蛋白抽提试剂)抽提总蛋白。 
  2、蛋白质定量
  按BCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作,测定样品浓度。 
  3、变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE) 
  将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样,标准加进第一个孔中,电泳分离蛋白。 
  4、蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF膜 
  5、膜的封闭和抗体孵育 
  A、膜在5%BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。
  B、封闭过的膜加入一级抗体室温孵育1.5小时,抗原抗体结合。
  C、加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准,室温孵育膜1小时。加入HRP标记的GAPDH抗体可同时检测GAPDH含量。
  6、结果检测
   化学发光法检测,膜与化学发光底物孵育,经X胶片曝光显影。图片扫描保存为电脑文件,并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。
  7、数据分析 
   目的蛋白的灰度值除以内参GAPDF的灰度值以校正误差,所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。 
  8、提供实验报告
  包括详细的实验方法及Western Blot实验结果。

如何下单:

1. 邮件咨询下单:填写实验项目的信息后,发送至邮箱2062834891@qq.com

2. 在线咨询下单:点击屏幕右侧“在线咨询”,或扫描二维码添加微信,或拨打咨询电话15810756989,我们会尽快安排工作人员与您联系!